關于光合作用測量儀器,您必須知道的使用要點
日期:2020-03-12 17:27:10

提起光合作用測量儀器,

可能很多人都會答,

這個我知道,光合儀和熒光儀嘛!

那我再問,光合儀和熒光儀具體都測什么?

如何選擇?哪個更好用?

突然好多概念,參數浮現在腦海,

我們好像在哪見過!

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OK!坐好,手背后邊,

睜大眼睛,豎起耳朵,

聽小編來給你們“瞎扯”一番。


—— 光合作用的光&合 ——


Photosynthesis=Photon(光)+Synthesis(合),光合作用可分為光反應和暗反應。


光反應:發生葉綠體的類囊體膜上,以光能捕獲傳遞轉化為基礎的光能利用,氧氣釋放和電子傳遞。


暗反應:發生在葉綠體基質內,以CO2吸收同化合成為基礎的酶促反應,羧化,還原,再生。


>> 總結 <<


光反應:反應相對快,光子轉化成電子實現太陽能的初級利用。涉及到光能轉換效率,激發能耗散途徑,電子傳遞速率,NADPH和ATP合成。


暗反應:反應相對慢,吸收CO2,通過酶促反應利用光反應產生的還原劑,合成糖類,淀粉,實現活躍化學能到穩定化學能的轉化。涉及氣孔導度,葉肉導度,蒸騰速率,羧化效率。

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—— 光反應和暗反應的測量儀器 ——


光合儀:氣體交換原理,利用紅外氣體分析器(InfraRed Gas Analyzer IRGA)測量流經葉片前后CO2和H2O的濃度變化,分析葉片與環境發生的氣體交換,用固定了多少CO2來表征光合作用的能力。常用的參數是凈光合速率,蒸騰速率,氣孔度,胞間二氧化碳濃度等。氣體交換是非常經典的光合作用測量方法,光合儀是常被用來測量氣體交換的儀器。


熒光儀:葉綠素熒光原理,通過檢測光合作用光能利用過程中葉綠素熒光的產量(F),來分析光合作用光能吸收,轉化和分配。用葉綠素熒光參數來表征不同途徑能量分配的多少。常用的參數有光系統的最大光能轉換效率(Fv/Fm), 實際光能轉換效率(Yield), 光化學淬滅(qP), 非光化學淬滅(NPQ), 電子傳遞速率(ETR)等。葉綠素熒光法具有無損,原位測量等優勢,可以作為光合作用的有效探針,葉綠素熒光儀廣泛應用于實驗室和野外光合作用研究。


>> 總結 <<


光合作用和蒸騰作用相伴發生,光合儀測量葉片和環境的氣體交換。交換的氣體是H2O和CO2,交換的門戶是氣孔,交換的結果是水分從葉片中蒸騰散失,CO2進入葉片被同化。光合儀測量光合作用極易受到環境濕度,CO2濃度,光照,溫度的影響,測量過程中應盡量保持環境條件穩定。


光能的吸收與耗散平衡,熒光儀測量吸收光能中用于發射熒光的部分,根據模型計算轉化為光合電子傳遞和熱耗散的部分。熒光儀測量的葉綠素熒光通常指的是室溫(25℃)葉綠素熒光,熒光儀測量光合作用主要受光照強度(PAR)和溫度的影響。


—— 如何選擇或哪個更好用?——


任何一種儀器的選擇,

都要服從科研內容對工具的需求!


舉個例子,一個種質資源管理中心,如果要收集200個水稻品種的田間光合特性數據,可以嘗試使用熒光儀測量實際光能轉化效率即可,熒光儀可以在短時間內測量大量樣品。換一個角度,如果是要評估改良的新品種和本之間的光合差異,則建議使用光合儀來測量,畢竟固定CO2生成糖和淀粉才是作物產量的保證。你品,你細品!


光合儀和熒光儀可以獨立存在,但是光反應和暗反應不會獨立運行。所以,兩者沒有絕對意義上的高下,因為光反應和暗反應同樣重要。如果想全面的分析光合作用,光合儀和熒光儀都需要用到,最佳的使用方案是聯用,同步測量氣體交換和葉綠素熒光。


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—— 使用光合儀和熒光儀要注意什么?——


>> 光合儀 <<


1、預熱!預熱!預熱!所有IRGA原理的光合儀都需要預熱!不同品牌的光合儀預熱時間不同,實際應用中預熱的時間約為30-60分鐘。


2、分析器調零,調零的目的是為了消除光合儀的檢測誤差。不同品牌,不同型號的光合儀,根據IRGA類型的不同,調零模式有差異。目前比較常見的是雙通道四分析器光合儀,雙通道是Reference和Sample兩股氣路通道,四分析器分別是H2O Reference分析器和CO2 Reference分析器,H2O Sample分析器和CO2 Sample分析器。在測量葉片前先測量分析器的讀數差異并將其固定即視為調零,之后才可以進行氣體交換的測量。


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調零氣路

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測量氣路


3、精確控制環境因子(光、溫、水、氣),光合儀主要采用開放式氣路系統,即光合儀從環境中吸取空氣,測量流經葉片前后CO2和H2O的濃度變化,測量后的氣體從出氣口流走。環境空氣的溫度,濕度,CO2濃度及環境的光強劇烈波動會嚴重影響光合儀的使用。因此建議在使用過程中精確控制環境因子。


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4、原位測量,嚴禁離體,因為離體葉片生理狀態會發生變化,最明顯的就是氣孔關閉。除了離體損傷之外,可能會導致氣孔關閉的還有手上的汗液或化妝品殘留等,所以不要直接用手擦拭葉片。


5、葉片面積(或重量),光合儀計算的光合速率是單位面積(或重量),單位時間內的CO2同化率,測量時需要已知的測量面積(或重量)。現在有些品牌的光合儀允許測量完成后修正測量面積(或重量),重新計算光合速率,如德國WALZ的GFS-3000。


6、葉片溫度,葉片溫度是計算光合參數和控制氣體交換溫度的重要依據。因為光合儀的測量原理默認肉細胞內為100% 相對濕度。


7、葉室氣流流速,流經葉室的氣流流速,與氣體交換參數計算有關。光合能力弱的陰生植物可以嘗試低流速測量。


8、日常維護,光合儀屬于精密的氣體分析儀器,為保證測量的準確性,應該定時做標定,標定程序分為CO2和H2O分析器零點標定和CO2和H2O分析器跨度標定。光合儀在環境因子控制過程中會消耗一些藥品,如干燥劑和堿石灰等,使用前后要注意檢查。光合儀作為野外便攜式測量設備,時常會被帶到野外去實驗,使用中務必留意電池電量狀況,及時保存數據,使用前后及時給電池充電。特別提醒,遠離水源!


>> 熒光儀 <<


1、熒光儀的種類,目前常用的葉綠素熒光儀有兩種,脈沖調制式的和連續激發式的。脈沖調制式的可以在有環境光為背景的情況下使用,連續激發式的不可以。但是連續激發式的時間分辨率比脈沖調制式的高。脈沖調制式的葉綠素熒光儀通常用來測量淬滅分析,快速光曲線等。連續激發式的通常用來做快分析。


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2、暗適應,為了更好的對葉綠素熒光測量進行合理的解釋,如何定義光合機構在測量開始時的狀態非常重要。所以,在大多數實驗中,無論脈沖調制式還是連續激發式葉綠素熒光儀,測量前一般需要首先進行暗適應。葉片的暗適應狀態是光合機構的基本狀態。暗適應的方式有很多種,整株植物置于暗室,單個葉片放入暗適應夾,夜間測量。暗適應的時間長短取決于我們希望從葉綠素熒光中得到什么信息。例如,大田作物葉片光合能力評價,暗適應時間一般只需要30分鐘。而實驗室內擬南芥葉片跨膜質子梯度ΔpH的測量則需要幾個小時甚至更長。


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3、熒光儀光源,在熒光參數測量前對熒光儀光源有明確的認識是非常有必要的。以調制式的葉綠素熒光儀為例,通常會配置四種光,測量光ML,光化光AL,飽和脈沖光SP,遠紅光FR。測量光,光強比較弱(<1μmolm-2s-1),具有調制頻率,用于信號檢測,測量前需要調整測量光強度(Int.)和頻率(Freq.)使熒光信號達到基本檢測要求。測量光強度過高, Fm 測定時可能會因為過飽和被低估,如果測量光強度太低,則不會使用滿量程,誤差增大。光化光,是誘導植物發生光合作用的光,又叫作用光。常見的熒光儀光化光光源有兩種, 460nm左右的藍光或630nm左右的紅光。光化光的強度通常也是可以調節的,以適應不同的實驗需求。但是請注意,光源出口與樣品的距離會改變樣品表面的光強。所以測量前務必明確到達樣品表面的光強具體是多少。很多設備的出廠設置都是預設的,安裝調試時最好執行光強校準,確保軟件或者報告里的PAR值與樣品水的實際光強值一致。飽和脈沖,脈沖調制式熒光儀除了上述兩種光還有一種飽和脈沖光,而連續激發式熒光儀通常只有飽和脈沖光。飽和脈沖在熒光儀中通常是用來計算數據的,光強比較強,一般都要大于3000μmolm-2s-1。為適應不同樣品類型和實驗要求,飽和脈沖的強度和持續時間通常也是可以調節的。遠紅光,有些品牌或型號的熒光儀還會搭載用于激發光系統Ⅰ的遠紅光,遠紅光可以用來測量Fo’,暗弛豫,狀態轉換。


4、Fv/Fm, (Fm-Fo)/Fm,最大光能轉換效率,反應植物潛在的最大光合能力。通過測量暗適應之后的最小熒光Fo和最大熒光Fm計算而來。該參數相對獨立,可以單獨使用,來評估脅迫條件下植物的光合特性變化或用來篩選突變體。大多數熒光儀都可以測。


5、ΦPSII,(Fm’-F)/Fm’, 實際光能轉換效率,反應植物在穩態下的實際光合能力,通過測量穩定環境(光溫水汽)狀態下的最小熒光F和最大熒光Fm’計算而來。可以在晴朗的天氣,快速測量大量植物的光合特性。測量過程要同時采集環境參數,如光強,溫度等。


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6、誘導曲線,Induction Curve,慢速熒光誘導動力學(Slow Kinetics)的一種。測量誘導曲線可以獲得淬滅分析(Quenching Analysis)的參數,光化學淬滅(qP), 非光化學淬滅(NPQ)。實際應用中,誘導曲線后可以增加暗弛豫的測量,進一步分析植物非光化學淬滅的能力。完整操作如下,先通過光化光誘導植物葉片達到穩態,測量光化學淬滅和非光化學淬滅。然后關閉光化光,打開遠紅光,繼續測量,直到植物在暗處再次達到穩態,測量暗穩態下的熒光淬滅。謹記,誘導曲線的測量需要暗適應。


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7、光曲線,Light Curve,測量不同光強下的量子產量,計算電子傳遞速率ETR(ETR=PAR*Yield*吸光系數*0.5)。光曲線是光響應曲線的一種表征方式,相對于光合儀測氣體交換的A/Q曲線,熒光儀測量light Curve的時間可以短得多,所以又被稱為快速光曲線(RLC)。光曲線可以擬合得到光能利用效率α,最大電子傳遞速率ETRmax,半飽和光強Ik,實現不同樣品光合特性的對比。


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8、熒光成像,普通的熒光儀通常以數據報告的形式呈現測量結果,而熒光成像則可以將數據圖像化,直觀的展現樣品間的光合特性差異,極大地擴展了葉綠素熒光技術的應用。如今,熒光成像早已經成為光合生理研究,遺傳育種,突變體篩選,病蟲害早期檢測的常用工具。相比于普通的熒光儀,熒光成像的測量面積大,全葉片成像有助于分析葉片的橫向異質性。熒光成像并不是面積越大越好,比面積更重要的是成像區域光場的均一性。均勻的廣場保證了葉片每一個部位的照光條件一致,實驗結果才更可靠。所以熒光成像的光源布局要經過精心的的設計,就像手術臺的無影燈,照亮每一個看得見的角落。

        

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熒光參數圖像(Belén Naranjo,etal. 2016)


再次聲明,光合作用研究儀器沒有好壞之分,DIY或Custom-Made的測量系統照樣可以發好文章。正所謂光合儀器測量的數據千篇一律,有趣的idea萬里挑一。再次祝各位老師,用好儀器,做好實驗,講好故事,發好文章!


相關產品:

便攜式光合測量系統——GFS-3000

雙通道調制葉綠素熒光儀——DUAL-PAM-100

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